Po 25 dňoch statickej inkubácie pri teplote 28 °C vykazovala lakáza z *Pleurotus ostreatus* NRC620 najvyššiu aktivitu v kultivačnom médiu húb. Optimálne hodnoty pH a teploty pre tento enzým boli 3,0 a 70 °C. Po 2 hodinách inkubácie pri teplote 40 °C a 50 °C si aktivita enzýmu zachovala 68,33 % a 59,61 %. Po 2 hodinách inkubácie v citrátovo-fosfátovom pufri (pH 7,0) zostala aktivita enzýmu na 100 %. Pridanie 10 mM MgSO₄ a CuSO₄ zvýšilo aktivitu enzýmu približne o 21 % a 35 %, zatiaľ čo NaCl, MnCl₂, KCl a CaCl₂ aktivitu enzýmu inhibovali. Pri použití ABTS ako substrátu boli kinetické parametre (Km a Vmax) lakázy *Pleurotus ostreatus* NRC 620 1,99 mM a 16 217 μmol min−1 L−1. Enzymatická úprava vzoriek jablkovej šťavy významne znížila pH aj viskozitu a toto zníženie korelovalo so zvýšením doby skladovania. Ošetrenie lakázou viedlo k miernemu poklesu celkového obsahu fenolov v jablkovej šťave, ale nepozorovalo sa žiadne zníženie antioxidačnej aktivity.
V posledných rokoch sa výskumníci zamerali na aplikáciu zelenej biotechnológie v potravinárskom priemysle. Lakáza je jedným z najužitočnejších enzýmov v potravinárskom priemysle a nachádza uplatnenie v oblastiach, ako je spracovanie štiav, pečenie, stabilizácia vína a zlepšenie organoleptických vlastností potravinárskych výrobkov.1Mnoho vyšších rastlín a mikroorganizmov vylučuje lakázu,2a huby ako deuteromycéty, askomycéty a basidiomycéty môžu tiež produkovať lakázu.3Lakáza (EC 1.10.3.2) je modrá oxidáza, ktorá redukuje molekulárny kyslík na vodu pomocou systému pozostávajúceho z troch rôznych atómov medi, čím oxiduje rôzne fenolové zlúčeniny a aromatické amíny. Počas výroby ovocných a zeleninových štiav je enzymatické a neenzymatické hnednutie kritickým faktorom.4Keďže tieto látky negatívne ovplyvňujú farbu, chuť a arómu šťavy, musia sa odstrániť.5
Zo všetkého ovocia sú jablká najviac konzumované na celom svete a v Európskej únii. V roku 2019 sa produkcia jabĺk umiestnila na treťom mieste na svete, presiahla 87 miliónov ton.6Jablká obsahujú množstvo fenolických zlúčenín vrátane flavonoidov a fenolických kyselín, ako je kyselina kávová a kyselina chlorogénová.7Keďže sa jablková šťava zvyčajne konzumuje v čírej forme, počas procesu filtrácie sa stráca približne 50 % až 90 % fenolických zložiek.8Dnes majú spotrebitelia tendenciu vyberať si minimálne spracované produkty, ako napríklad zakalený jablkový džús s vysokým obsahom polyfenolov. Vzhľadom na vysoký obsah fenolov je však tento druh jablkového džúsu obzvlášť náchylný na zmenu farby a stmavnutie.9Na zníženie alebo zabránenie tmavnutia jablkovej šťavy sa používajú rôzne technológie vrátane metód tepelného spracovania, ako je pasterizácia pri teplote 60 – 90 °C.10Avšak podľa výskumu Sauceda-Gálveza11Tepelné spracovanie môže zničiť prchavé chemikálie a ovplyvniť organoleptické vlastnosti jablkovej šťavy. Medzi alternatívy k metódam tepelného spracovania patrí superkritický oxid uhličitý, ultrafialové žiarenie, ultrazvuk, vysoký hydrostatický tlak alebo homogenizácia za vysokého tlaku.12Účinnosť týchto technológií a výťažnosť vhodných ovocných štiav závisia od použitých parametrov a charakteristík produktu. Ich široké využitie je obmedzené vysokými nákladmi, nepriaznivými účinkami na kvalitu niektorých potravinárskych výrobkov alebo nedostatočnou inaktiváciou enzýmov.13, 14
Lakáza sa môže použiť na stabilizáciu a čírenie ovocnej šťavy.15Gökmen a kol.16Odporúčajú použitie lakázy na čírenie ovocných štiav, pretože účinne odstraňuje fenolové zlúčeniny ich premenou na polyméry alebo oligoméry, ktoré sa dajú ľahko odstrániť akoukoľvek ultrafiltračnou membránou, čo umožňuje jablkovej šťave udržať si stabilnú farbu a čírosť až šesť týždňov pri teplote 50 °C. Purifikovaná lakáza *Trichoderma* bola imobilizovaná na guľôčkach oxidu hlinitého a použitá na selektívne odstránenie nežiaducich zlúčenín spôsobených mikrobiálnou kontamináciou jablkovej šťavy.17
Približne 80 – 90 % prchavých zložiek jablkovej šťavy tvoria estery a aldehydy, ktoré šťave dodávajú jedinečnú arómu.18Lakáza z *Trametes versicolor* bola imobilizovaná na lacnom nosiči vyrobenom z prírodných vlákien z mladých kokosových škrupín na čírenie jablkovej šťavy.19Predchádzajúce štúdie skúmali stabilizáciu jablkovej šťavy (farba a zákal) pomocou bezenzýmových alebo imobilizačných metód, alebo v kombinácii s ultrafiltráciou.5,19Vplyv hubových lakáz na fyzikálno-chemické vlastnosti jablkovej šťavy počas skladovania však zostáva nejasný. Cieľom tejto štúdie bolo preto experimentálne preskúmať zmeny fyzikálno-chemických vlastností, obsahu fenolických zlúčenín a antioxidačnej aktivity jablkovej šťavy po ošetrení hubovými lakázami a dvojtýždňovom skladovaní v chladničke. Lakázy majú schopnosť oxidovať fenolové zlúčeniny, čo ich robí sľubnými pre použitie v rôznych priemyselných procesoch vrátane čírenia šťavy. Táto štúdia skúmala lakázy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620 so zameraním na ideálne podmienky pre ich aktivitu a účinnosť pri čírení šťavy. Zatiaľ čo výskum hlivy ustricovej (P. ostreatus NRC 620) je stále obmedzený, predchádzajúce štúdie skúmali enzýmy z rôznych hubových zdrojov, ako sú Trametes versicolor a Ganoderma lucidum. Cieľom tejto štúdie bolo zhodnotiť potenciálne využitie tohto enzýmu v potravinárskom priemysle a zdôrazniť jeho jedinečné vlastnosti, najmä jeho ideálne pH a teplotu.
Kyselina 2,2′-azooxybis(3-etylbenzotiazolín-6-sulfónová) (ABTS) bola zakúpená od spoločnosti Sigma-Aldrich (Kanada). Všetky ostatné činidlá boli analytickej kvality.
Zbierkové centrum mikrobiálnych kultúr Národného výskumného centra získalo známy kmeň hlivy ustricovej NRC620. Po subkultivácii bol tento kmeň skladovaný na šikmých agarových platniach so zemiakovou dextrózou pri teplote 4 °C. Metóda prípravy inokula bola nasledovná: 10 dní staré, plne vyvinuté mycélium bolo naočkované na platne so zemiakovou dextrózou a inkubované pri teplote 28 °C. Po 10 dňoch boli z agarového média pomocou sterilného kovového razníka odstránené tri mycéliové bloky s priemerom 12 mm a umiestnené do 250 ml Erlenmeyerových baniek s vatovými zátkami obsahujúcich 50 ml sterilizovaného kultivačného média (pH 5,0, ako predtým opísali Othman a kol.).20). Kultúry boli inkubované pri teplote 28 °C počas 18 dní. Kultúry boli potom filtrované cez filtračný papier Whatman č. 1 a výsledný supernatant slúžil ako zdroj enzýmu.
Aktivita lakázy bola stanovená s použitím ABTS ako substrátu. Reakčná zmes (2 ml) obsahovala 500 μl 0,3 mM ABTS (rozpusteného v 0,1 M citrátovom pufri sodnom, pH 4,5) a požadované množstvo vzorky enzýmu zriedeného destilovanou vodou.21,22Vzhľadom na to, že lakáza môže oxidovať ABTS pri izbovej teplote (28 °C ± 2), oxidácia ABTS bola stanovená meraním nárastu absorbancie pri 420 nm (ε420= 36 000 cm-1 M -1) pomocou UV spektrofotometra Agilent Carry-100. Na oxidáciu 1 μmol ABTS za minútu bola potrebná jedna jednotka lakázovej aktivity. Koncentrácia proteínu bola stanovená Bradfordovou metódou s použitím hovädzieho sérového albumínu ako vnútornej kontroly.23,24
Po získaní enzýmu z kmeňa hlivy ustricovej NRC 620 bola jeho aktivita meraná v rôznych kultivačných intervaloch počas 25 dní za statických podmienok pri teplote 28 °C.
Na štúdium vplyvu teploty na aktivitu lakázy sa experimenty uskutočnili v teplotnom rozsahu od 20 do 90 °C. Pred pridaním enzýmu a začatím reakcie sa pufor (0,1 M citrát sodný, pH 4,5) a substrát (ABTS) zmiešali a inkubovali sa 5 minút pri rôznych teplotách. Tepelná stabilita enzýmu sa hodnotila inkubáciou v 0,05 M fosfátovom pufri sodnom (pH 7,0) pri teplote 40, 50, 60 a 70 °C počas 2 hodín. Zvyšková aktivita sa potom hodnotila pomocou substrátu ABTS.
Vplyv pH na aktivitu lakázy sa hodnotil s použitím ABTS ako substrátu v 0,1 M citrátovo-fosfátových pufroch s rozsahom pH 2,5 až 7,0. Roztok enzýmu sa inkuboval pri teplote 40 °C počas dvoch hodín v 0,1 M citrátovom a Tris pufroch (pH 3, 4, 6 a 7) na posúdenie stability pH. Zvyšková aktivita s ABTS ako substrátom sa vypočítala po inkubácii.
Lakáza sa inkubovala 10 minút v sodno-fosfátovom pufri (0,05 M, pH 7,0) obsahujúcom rôzne kovové ióny (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ a Mn2+) v koncentráciách 2,5 mM a 10 mM. Potom sa pridal substrát (ABTS) na spustenie reakcie a bola stanovená relatívna aktivita.
Oxidácia ABTS lakázou pri rôznych koncentráciách (0,025 – 3 mM) bola meraná pri pH 4,5 na stanovenie kinetických parametrov (Vmax a Km). KinetikakonštantyPercentá Michaelisovej-Mentenovej rovnice boli vypočítané pomocou Lineweaver-Burkovho grafu, ktorý zobrazuje prevrátenú hodnotu reakčnej rýchlosti ako funkciu koncentrácie substrátu. Kinetické konštanty boli vypočítané z Lineweaver-Burkovho grafu pomocou softvéru GraphPad Prism verzie 6.01.
Po dôkladnom umytí jabĺk vodou z vodovodu boli prekrojené na polovicu a odšťavené pomocou plne automatického odšťavovača na jablká Braun MP80 (vyrobeného v Nemecku). Šťava bola prefiltrovaná cez štyri vrstvy gázy. Kontrolnej skupine neboli pridané žiadne enzýmy, zatiaľ čo do čerstvo pripravenej jablkovej šťavy bolo pridaných 2,0 % lakázy (najúčinnejšia testovaná koncentrácia), ktorá bola potom dva týždne skladovaná pri teplote 4 °C.
Titračná kyslosť (TA) a pH boli stanovené podľa metódy Boultona aal.27Hodnota pH každej vzorky sa merala pomocou digitálneho pH metra (pH meter JENWAY 3510). Titračná kyslosť (TA) sa vypočítala na základe kyseliny jablčnej pomocou nasledujúceho vzorca.
Kde V a C sú objem (ml) a koncentrácia (0,1 mol/l) roztoku hydroxidu sodného použitého pri titrácii. K je konverzný koeficient kyseliny jablčnej, rovný 0,067, a W je hmotnosť (g) jablkovej šťavy.
Celkové rozpustné pevné látky (TDS) obsah vo všetkých vzorkách šťavy bol stanovený pomocou vreckového refraktometra PAL-1 (ATAGO, Tokio, Japonsko). Po každom meraní bola optická šošovka opláchnutá deionizovanou vodou a každá vzorka jablkovej šťavy bola testovaná trikrát. Hodnota pre každú vzorku bola vypočítaná spriemerovaním troch meraní. Priemerná hodnota ± štandardná odchýlka pre každú vzorku jablkovej šťavy bola tiež vypočítaná spriemerovaním týchto výsledkov.
Viskoelasticita vzoriek jablkovej šťavy bola hodnotená pomocou rotačného viskozimetra (RV, Rheotest 2, Nemecko). Vzorka bola umiestnená vo vnútri valca „S2“ viskozimetra. Zdanlivá viskozita bola reprezentovaná sklonom krivky šmykového napätia oproti šmykovej rýchlosti, ktorá bola vypočítaná zo šmykového napätia a zodpovedajúcich kriviek pri rôznych šmykových rýchlostiach (od 1,00 do 437,4 s⁻¹). Vzorec na výpočet zdanlivej viskozity je nasledovný:
Kde η je zdanlivá viskozita (cP), τ je šmykové napätie (dyn/cm²), γ je šmyková rýchlosť (s⁻¹) a (τ) sa vypočíta pomocou hodnôt krútiaceho momentu (α) a valca (Z) podľa nasledujúceho vzorca: τ = Z . α.
Index hnednutia bol stanovený podľa metódy Meidav et al.al.29Vzorka šťavy s objemom 10 ml sa centrifugovala pri 2750 x g počas 10 minút. 5 ml supernatantu šťavy sa zmiešalo s 5 ml 95 % etanolu. Absorbancia zmesi sa merala pri 420 nm pomocou UV spektrofotometra Shimadzu (UV-1601 PC).
Celkový obsah fenolov (TPC) sa stanovil kolorimetricky s použitím Folin-Ciocalteuovho činidla podľa Boultona a kol.[27]]. Štandardná krivka kyseliny galovej bola zostrojená pre koncentrácie od 0 do 500 mg/l (r²= 0,997). Výsledky sú vyjadrené ako ekvivalenty kyseliny galovej (mg GAE/ml).
Pridajte 125 μl destilovanej vody a 2850 μl roztoku FRAP k 25 μl jablkovej šťavy a nechajte zmes v tme30min. Potom zmerajte absorbanciu pri 593 nm pomocou UV spektrofotometra Shimadzu (UV-1601 PC). Činidlo FRAP sa pripravilo zmiešaním 300 mM acetátového pufra (pH 3,6), 20 mM chloridu železitého a 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazínu (TPTZ) (rozpusteného v 40 mM HCl) v pomere 10:1:1. Štandardná krivka sa vygenerovala s použitím Troloxu ako štandardu (R²= 0,999) a výsledky sú vyjadrené ako μM Troloxu/ml.
Antioxidačná aktivita upravených a neupravených štiav bola stanovená pomocou metódy DPPH na vyhodnotenie ich schopnosti zachytávať voľné radikály DPPH.31Desať mikrolitrov šťavy sa zmiešalo s 1 ml roztoku DPPH (100 μM) v metanole. Po 30 minútach reakcie v tme sa merala absorbancia zmesi pri 517 nm pomocou UV spektrofotometra Shimadzu (UV-1601 PC). Výsledky sa vyjadrili ako ekvivalenty troloxu (μM troloxu/ml) na základe kalibračnej krivky (R2= 0,990).
Získané údaje ukázali, že maximálna produkcia lakázy bola pozorovaná v hlive ustricovej NRC 620 do konca 18. dňa fermentácie, pričom aktivita dosiahla 1302 U/l. To slúžilo ako základ pre určenie optimálneho času kultivácie na produkciu lakázy (obrázok 1). Hoci produkcia enzýmu sa zvyšovala so zvyšujúcim sa časom kultivácie, rýchlosť nárastu nebola priamo úmerná času kultivácie; po 21 dňoch sa aktivita enzýmu zvýšila iba o 90 U/l (na 1390 U/l). Preto bolo nakoniec za optimálny čas kultivácie zvolených 18 dní, aby sa vyvážil výťažok produktu s ekonomickými výhodami predĺženého času kultivácie.
Vplyv času kultivácie na výťažok lakázy v Pleurotus ostreatus NRC 620. Tri (12 mm) bloky mycélia húb boli naočkované do 50 ml sterilného média a potom kultivované pri teplote 28 °C počas rôznych časov.
V súlade s inými štúdiami naše výsledky naznačujú, že ideálne obdobie kultivácie na dosiahnutie maximálnej sekrécie lakázy hubami je pravdepodobne medzi 7 a 36 dňami.32Podľa Ezike a kol.33*Trametes polyzona* WRF03 produkoval najvyššie množstvo lakázy do konca deviateho dňa fermentácie so špecifickou aktivitou 1637 U/mg bielkovín. Okrem toho Othman a kol.34zistili, že *Trichoderma harzianum* S7113 vylučovala veľké množstvo lakázy na piaty deň kultivácie. Rýchlosť produkcie lakázy dosiahla vrchol aktivity na štrnásty deň a potom postupne klesala.34Hoci k sekrécii enzýmov môže dôjsť aj počas hlavnej rastovej fázy, zvyčajne vrcholí počas prechodnej fázy a je spúšťaná konzumáciou zdroja uhlíka alebo dusíka.34,35
Hoci lakáza z Pleurotus ostreatus NRC 620 vykazovala vysokú aktivitu v širokom teplotnom rozsahu od 50 °C do 80 °C, pričom sa blížila k vrcholu aktivity (69 – 98 %), jej maximálna aktivita bola pozorovaná pri 70 °C (obr. 2a). Mimo tohto teplotného rozsahu sa aktivita enzýmu znížila približne pri 70 °C. Tieto výsledky naznačujú, že enzým je aktívny pri vysokých teplotách, pravdepodobne preto, že vysoká teplota zvyšuje kinetickú energiu reakcie.
Vplyv reakčnej teploty (a) a pH (b) na aktivitu lakázy v *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Teploty v rozmedzí od 20 do 90 °C sa dosiahli predinkubáciou zmesi pri rôznych teplotách počas 5 minút pred pridaním enzýmu a začatím reakcie. Vplyv pH na aktivitu lakázy sa hodnotil pomocou ABTS ako substrátu v roztokoch obsahujúcich 0,1 M citrátovo-fosfátový pufor v rozsahu pH 2,5 až 7,0.
Podľa Ezikeho a ďalšíchal.33Optimálna teplota pre lakázu *Trametes polyzona* WRF03 je 55 °C, čo je rovnaká teplota ako pre *Ganoderma lucidum*laccase36a podobná optimálnej teplote (50 °C) pre *Trametes polyzona* KU-RNW02737lakáza . Baldrian38poznamenáva, že rovnako ako v prípade iných enzýmových systémov degradujúcich lignín je ideálny teplotný rozsah pre lakázu medzi 50 a 70 °C.
Výsledky ukázali, že enzým vykazoval najvyššiu aktivitu pri pH 3,0, pričom dosiahol 94 % aktivity pri pH 3,5. Zostal však aktívny v širokom rozsahu pH od 2,5 do 7,0 (obrázok 2b). Okrem toho vykazoval vyššiu aktivitu v kyslých podmienkach v porovnaní s neutrálnymi alebo alkalickými podmienkami. Jeho aktivita zostala najmenej 77 % v rozsahu pH od 2,5 do 4,5, ale dosiahla iba približne 38 % pri pH 7,0. Optimálne pH pre lakázu z *Trametes polyzona* WRF03 bolo 4,533, čo je rovnaké ako pH pre lakázy z *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 a *Trametes hirsuta* 41. Avšak podľa štúdie Chairina a kol.42, optimálne pH pre lakázu z *Polymorpha f. sp.* WR710-1 je 2,2, zatiaľ čo optimálne pH pre lakázu z *Polymorpha f. sp.* IBL-04 je 5,043. Väzba hydroxidových aniónov (inhibítor lakázy) na atómy medi T2/T3 lakázy môže byť dôvodom zníženej aktivity lakázy za neutrálnych alebo alkalických podmienok pH. To môže narušiť vnútorný prenos elektrónov z centra T1 do centra T2/T3, čím...obmedzujúceaktivita enzýmu23,44
Inkubáciou enzýmu pri rôznych teplotách sa zistilo, že stabilitu enzýmu ovplyvňuje tak čas inkubácie, ako aj teplota. Lakáza z *Trametes polyzona* NRC 620 vykazovala vyššiu stabilitu pri 40 ℃ a 50 ℃, pričom si po 120 minútach zachovala 68,33 % a 59,61 % svojej počiatočnej aktivity (obrázok 3a). Naproti tomu za rovnakých podmienok (40 ℃ a 50 ℃, 120 minút) si lakáza z *Trametes polyzona* WRF03 zachovala 64,38 % a 42,92 % svojej aktivity.33Naopak, zvýšenie inkubačného času a teploty znížilo stabilitu lakázy *Trametes polyzona* NRC 620; Po inkubácii pri teplote 60 ℃ a 70 ℃ počas 60 minút sa jej aktivita znížila na 39,24 %, respektíve 1,72 % (obrázok 3a). V súlade s experimentálnymi výsledkami vykazovala lakáza z *Trametes polyzona* WRF03 vyššiu stabilitu pri teplote 40 a 50 ℃ počas celého procesu tepelného spracovania.33Podobne Lueangjaroenkit a ďalšíal.37a predseda a ďalšíal.42uviedli stabilitu lakáz z Trametes polyzona KURNW027 a Trametes polyzona WR710-1 pri teplote 50 °C počas 1 hodiny. Ako užitočný biokatalyzátor použiteľný v rôznych biotechnologických oblastiach by lakáza mala mať dobrú stabilitu a výkon v širokom teplotnom rozsahu.
Termostatická stabilita (a) a pH stabilita (b) lakázy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Termostatická stabilita bola hodnotená inkubáciou roztoku enzýmu v 0,05 M fosfátovom tlmivom roztoku sodnom (pH 7,0) pri teplote 40, 50, 60 a 70 °C počas 2 hodín. Stabilita pH bola hodnotená inkubáciou roztoku enzýmu v 0,1 M citrátovom tlmivom roztoku a Tris tlmivom roztoku (pH 3, 4, 6 a 7) pri teplote 40 °C počas 2 hodín. Zvyšková aktivita bola vypočítaná s použitím ABTS ako substrátu po inkubácii.
Aby sme určili optimálne podmienky pre použitie a skladovanie enzýmu, skúmali sme vplyv pH na stabilitu lakázy. Vystavenie rôznym hodnotám pH významne ovplyvnilo stabilitu proteínovej štruktúry, a tým aj stabilitu a aktivitu molekuly enzýmu. Výsledky ukázali, že enzým bol menej stabilný v kyslých podmienkach, zatiaľ čo lepšiu stabilitu vykazoval pri vyšších hodnotách pH (neutrálne a alkalické oblasti). Pri hodnotách pH 7,0, 6,0, 4,0 a 3,0 bola miera retencie enzýmu po 120 minútach približne 100 %, 62,54 %, 52,39 % a 11,14 % (obr. 3b). Lakáza *Strombus multisus* WRF03 vykazovala vyššiu stabilitu pri neutrálnych hodnotách pH (5,5–6,5) a nižšiu stabilitu pri kyslých hodnotách pH (pod 4,0). Po 120 minútach pri hodnotách pH 5,5, 6,0 a 6,5 bola miera retencie enzýmov približne 82 %, 100 % a 93 %.33Khairin a kol.42poznamenali, že lakáza z Trametes polyzona WR710-1 bola stabilná v rozsahu pH 6,0 až 7,0, zatiaľ čo Sayed a kol.45ukázali, že lakáza bola stabilnejšia za podmienok neutrálneho pH. Lakáza z Cerrena unicolor však vykazovala stabilitu aj za alkalických podmienok (pH 9,0).46Študované lakázy vykazovali vysokú stabilitu v širokom rozsahu pH. To môže byť dôležitá vlastnosť pre priemyselné aplikácie.
Keďže niektoré kovové ióny majú stimulačné aj inhibičné účinky na aktivitu enzýmov, ich vplyv na aktivitu enzýmov sa musí zohľadniť v priemyselných aplikáciách. To je kľúčové, pretože kovové ióny sú bežnými kontaminantmi životného prostredia, ktoré môžu ovplyvniť stabilitu a syntézu extracelulárnych enzýmov.47Aby sme preskúmali vplyv viacerých kovových iónov na lakázu z *Pleurotus ostreatus* NRC 620, vykonali sme zodpovedajúce experimenty. Ako je znázornené na obrázku 4, v závislosti od použitého typu kovu, zvýšenie koncentrácie kovových iónov z 2,5 mM na 10 mM negatívne ovplyvnilo funkciu enzýmu. Napríklad,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺aCu²⁺mohol stimulovať a aktivovať aktivitu enzýmov, zatiaľ čoNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺aK⁺mohol inhibovať aktivitu enzýmu. Pri koncentrácii 10 mM boli ióny Cu²⁺ a Mg²⁺ najúčinnejšími aktivátormi lakázovej aktivity z *Pleurotus ostreatus* NRC 620, pričom dosiahli stupeň aktivácie približne 34 %, respektíve 20 %. Avšak pri koncentrácii 10 mM boli ióny Ca²⁺ najúčinnejším inhibítorom lakázy, pričom znížili aktivitu enzýmu približne o 60 %.
Vplyv kovových iónov na aktivitu lakázy Pleurotus ostreatus NRC 620. Lakáza bola inkubovaná 10 minút v tlmivom roztoku fosforečnanu sodného (0,05 M, pH 7,0) obsahujúcom rôzne kovové ióny v koncentráciách 2,5 mM a 10 mM. Reakcia bola potom iniciovaná pridaním substrátu (ABTS), po čom bola meraná relatívna aktivita.
Naše výsledky sú v súlade s výsledkami iných autorov, ktorí zistili, že Mg²⁺ a Cu²⁺ zvyšujú aktivitu *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño a kol.⁴⁸ zistili, že lakáza z *Xylaria* sp. je do určitej miery stimulovaná iónmi medi (Cu²⁺). Okrem toho Foroutanfar a kol.⁴⁹ a Si a kol.⁵⁰ vykonali podobné štúdie na lakázach z *Paraconiothyrium variabile* a *Trametes pubescens*. Väzbové miesto medi typu II (T2) tohto enzýmu môže byť pri danej koncentrácii nasýtené Cu²⁺, čo môže vysvetľovať stimuláciu aktivity lakázy pri vyšších koncentráciách Cu²⁺³⁹. Keďže lakázy húb bielej hniloby sú oxidázy obsahujúce viacero atómov medi, účinky iónov medi na aktivitu lakázy sú rôznorodé a siahajú od stimulačných a inhibičných až po neutrálne.⁵¹ Naproti tomu Zhou a kol.[52]uviedol, žeCu²⁺inhiboval lakázovú aktivitu taiwanského podzemného termita (Odontotermes formosanus). Avšak lakázy Cerena sp. HYB07[53]a Clitocybe maxima[54]neboli ovplyvnené iónmi medi.
Špecificita substrátu bola reprezentovaná jeho kinetickými parametrami (Km a Vmax); čím silnejšia je väzbová afinita substrátu k enzýmu, tým nižšia je hodnota Km a tým vyššia je špecifickosť substrátu.3,21,55Kinetické parametre (Km a Vmax) lakázy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620 boli stanovené pomocou softvéru GraphPad Prism 6.0 vykreslením Lineweaver-Burkovej krivky (obrázok 5). Pri použití ABTS ako substrátu boli výsledky 1,99 mM a 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,Elsayed a kol.21uviedli, že hodnoty Km pre oxidáciu ABTS boli 0,1 mM a 0,064 mM, čo naznačuje vysokú afinitu izoenzýmov Lac A a Lac B k ABTS. Okrem toho boli hodnoty Vmax 0,182 μmol.min⁻¹a 0,603 μmolmin⁻¹, v uvedenom poradí. Získaná hodnota Km bola nižšia ako u Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); okrem toho bola aj ich hodnota Vmax (1429 mmol min⁻¹)nižšiepri použití ABTS ako substrátu.33 Podobne boli hodnoty Km koncentrácií lakázy Lentinus squarrosulus MR13 a Trametes sp. AH28-2 0,0714 mM a 0,025 mM a hodnoty Vmax boli 0,0091 mM min−1 a 0,67 mM min−1 mg−1 (v porovnaní s ABTS)., v uvedenom poradí.56,57
Bol skúmaný vplyv koncentrácie ABTS na aktivitu lakázy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620 a bol znázornený Lineweaver-Burkov graf prevrátenej hodnoty počiatočnej reakčnej rýchlosti oproti koncentrácii ABTS. Oxidačná reakcia ABTS s rôznymi koncentráciami (0,025 – 3,0 mM) lakázy bola meraná pri pH 4,5 na stanovenie kinetických parametrov (Vmax a Km). Kinetické konštanty Michaelisa-Mentena boli vypočítané pomocou Lineweaver-Burkovho grafu prevrátenej hodnoty reakčnej rýchlosti oproti koncentrácii substrátu. Kinetické konštanty boli vypočítané z Lineweaver-Burkovho grafu pomocou softvéru GraphPad Prism 6.01.
Tradičné číriace enzýmy, ako sú pektinázy, hydrolyzujú pektínové látky, čím znižujú viskozitu a zákal. Účinne rozkladajú štrukturálne polysacharidy a často sa používajú v kombinácii s inými enzýmami, ako sú celulázy a hemicelulázy, na zlepšenie výťažnosti a čírosti. Pektinázy však nie sú špecificky zamerané na fenolové zlúčeniny, ktoré sú hlavnými prispievateľmi k zákalu a oxidačnému hnednutiu, najmä v šťavách, ako je jablková a hroznová šťava.58Naproti tomu lakázy katalyzujú oxidáciu fenolových zlúčenín a polymerizujú ich na väčšie, nerozpustné molekuly, ktoré je možné odstrániť sedimentáciou alebo filtráciou. Tento mechanizmus nielen zlepšuje čírosť, ale tiež predlžuje trvanlivosť šťavy znížením pravdepodobnosti oxidačného hnednutia spôsobeného fenolickými zlúčeninami. Okrem toho sa procesy čírenia na báze lakázy môžu vykonávať za miernych podmienok spracovania (pH 3,5 – 5,5, teplota 25 – 40 °C), vďaka čomu sú vhodné pre jemné šťavy bez toho, aby sa ohrozili ich nutričné alebo organoleptické vlastnosti.59Štúdie ukázali, že ošetrenie pektinázou dokáže vyčistiť šťavu za 1 – 2 hodiny, zatiaľ čo ošetrenie lakázou zvyčajne vyžaduje dlhší reakčný čas (3 – 6 hodín) na úplnú redukciu fenolických zlúčenín. Tento proces sa však dá optimalizovať imobilizáciou enzýmu alebo kombináciou lakázy s mechanickými metódami čírenia.60V tejto štúdii enzymatické profilovanie surového extraktu odhalilo významnú aktivitu lakázy a α-amylázy, zatiaľ čo aktivita pektinázy a xylanázy bola extrémne nízka a aktivita celulázy nebola zistená. Zníženie zákalu a obsahu fenolov bolo preto spôsobené najmä pôsobením lakázy, zatiaľ čo zmena viskozity by mohla byť čiastočne spôsobená pôsobením amylázy.
Tabuľka 1 zobrazuje fyzikálno-chemické parametre čerstvo vylisovanej jablkovej šťavy a vzoriek ošetrených lakázou. Výsledky ukázali, že výťažok čerstvo vylisovanej jablkovej šťavy (71,59 %) bol nižší ako výťažok vzoriek ošetrených lakázou (87,34 %). Tieto výsledky sú v súlade so zisteniami Pilnika a Orangea.61, ktorý uviedol, že použitie enzýmov pri spracovaní ovocia môže zvýšiť výťažnosť šťavy, zlepšiť filtráciu a získať vysokokvalitnú, číru šťavu na zahustenie. Zvýšenie výťažnosti šťavy je spôsobené najmä zvýšením obsahu rozpustných cukrov v šťave. Počas enzymatickej hydrolýzy ovocia sa mezoglea a pektín v bunkových stenách produktu ničia a premieňajú na rozpustné látky, ako sú neutrálne cukry a kyseliny.62.Hodnota pH jablkovej šťavy ošetrenej enzýmami bola významne nižšia ako v kontrolnej skupine (P < 0,05) a hodnota pH oboch skupín sa počas skladovania významne zvýšila (Tabuľka 1). Tieto výsledky sú v súlade s výsledkami Marka a kol.63, ktorý poznamenal, že pH šťavy z kešu orieškov sa po skladovaní po tepelnom ošetrení znížilo. Degradácia pektínu a tvorba kyseliny galakturónovej po enzymatickom ošetrení môžu byť zodpovedné za zvýšenie pH počas skladovania. Hodnota pH vzoriek ošetrených enzýmami zostala počas celého skladovania medzi 4,05 a 4,31, zatiaľ čo pH neošetrenej jablkovej šťavy sa pohybovalo medzi 4,12 a 4,33.
Celková kyslosť (TA) neošetrených aj lakázou ošetrených vzoriek vykazovala klesajúci trend so zvyšujúcou sa dobou skladovania (Tabuľka 1). Pokles kyslosti sa pripisuje premene organických kyselín na sacharidy alebo enzymatickým reakciám, ako aj oxidácii počas skladovania šťavy.64Celková kyslosť kontrolnej jablkovej šťavy a vzoriek ošetrených enzýmami bola nižšia ako u iných štiav (jahodová šťava 0,9 %, slivková šťava 2,2 %, kumkvátová šťava 1,0 %, marhuľová šťava 2,4 %, pomarančová šťava 0,8 %), ale podobná ako u iných štiav (napr. hrušková šťava 0,3 %).62Tieto rozdiely v neošetrenej čerstvo vylisovanej jablkovej šťave môžu byť spôsobené rôznymi faktormi, ako sú pestovateľské podmienky, genetické faktory, úroveň zrelosti a metódy spracovania.65Pokles celkovej kyslosti kontrolnej a lakázou ošetrenej jablkovej šťavy je v súlade s výsledkami prezentovanými Singhom a kol.66pokiaľ ide o pokles celkovej kyslosti jablkovej šťavy Jin Nuo po 74 dňoch skladovania. Na druhej strane, Oshmiansky a Wojdylo67nezistili žiadne významné zmeny v kyslosti jablkovej šťavy pri skúmaní vplyvu tradičných metód čírenia.
Výsledky uvedené v tabuľke 1 naznačujú, že hodnota celkových rozpustných pevných látok (TSS) v jablkovej šťave ošetrenej lakázou bola vyššia ako v neošetrenej vzorke. Tieto výsledky sú v súlade s publikovanými štúdiami.68Tabuľka 1 ďalej ukazuje, že hodnota TSS kontrolnej skupiny s jablkovou šťavou bola v počiatočnom časovom bode 9,58 a na konci skladovacieho obdobia dosiahla 11,05. Tieto hodnoty sú nižšie ako hodnoty TSS čerstvej jablkovej šťavy, ktoré uviedli Hamid a kol.69(11,2 a 11,80). Hodnota celkového obsahu rozpustných látok (TSS) vzoriek jablkovej šťavy ošetrenej lakázou sa významne zvýšila, počnúc 11,23 a dosahujúc 12,93 po dvoch týždňoch skladovania pri teplote 4 °C (Tabuľka 1). Podobný nárast TSS počas skladovania sa pozoroval aj u citrusových plodov, citrónov a sladkých pomarančov. Nárast celkových rozpustných látok (TSS) počas skladovania môže byť spôsobený hydrolýzou polysacharidov (škrobu) na monosacharidy (cukry), zvýšením koncentrácie v dôsledku dehydratácie šťavy a degradáciou pektínu v šťave na rozpustné látky. Nárast celkových rozpustných látok (TSS) je pravdepodobne spôsobený zvýšením rozpustných cukrov, ktoré môžu vznikať premenou pektínu alebo celulózy na rozpustné cukry pektínom alebo celulázou, alebo hydrolýzou škrobu na cukry, ako uvádzajú Hamed a kol.69.Vplyv lakázy na vlastnosti jablkovej šťavy možno pozorovať vizuálne, pretože jablková šťava ošetrená lakázou vykazuje lepšiu tekutosť a nižšiu viskozitu ako neošetrená šťava. Toto pozorovanie je zaznamenané v tabuľke 1; Viskozita vzorky ošetrenej enzýmom bola 1,87 cP, zatiaľ čo viskozita kontrolnej vzorky bola 2,95 cP. Toto významné zníženie viskozity je pravdepodobne spôsobené vyššou schopnosťou zadržiavať vodu pektínom podobných látok a tvorbou súdržnej sieťovej štruktúry.
V tejto štúdii sa skúmal vplyv lakázy na index hnednutia (BI) jablkovej šťavy meraním absorbancie pri 420 nm pomocou spektrofotometra. Výsledky sú uvedené v tabuľke 1. Počas skladovania vykazoval BI vzoriek jablkovej šťavy v ošetrenej aj neošetrenej skupine postupný rastúci trend. BI odráža stupeň hnednutia a môže slúžiť akodôležitýindikátor enzymatických a neenzymatických reakcií hnednutia. Absorbancia sa počas skladovania významne zvýšila (P < 0,05). Na konci skladovania saA420Hodnota vzoriek jablkovej šťavy v kontrolnej skupine a skupine ošetrenej enzýmami sa zvýšila približne o 217 %, respektíve o 121 % (Tabuľka 1). Výsledky naznačujú, že ošetrenie enzýmami môže účinne znížiť stupeň hnednutia približne o 56 %. Výsledky Bezerru a kol.[19]] sú v súlade s našimi výsledkami; Na vyčistenie jablkovej šťavy použili lakázovo-glutaraldehydovo-kokosové vlákno, čím znížili jej pôvodnú farbu o 61 %.
Hoci polyfenoly v ovocných šťavách majú pozitívne nutričné a terapeutické účinky na ľudský organizmus, môžu tiež reagovať s bielkovinami, čo spôsobuje zakalenie šťavy, sedimentáciu alebo zákal, čím menia chuť a arómu produktu a skracujú jeho trvanlivosť.71Cieľom tejto štúdie bolo bezpečne znížiť obsah fenolických zlúčenín v jablkovej šťave pomocou lakázy z Pleurotus ostreatus NRC 620. Výsledky uvedené v tabuľke 1 ukazujú, že celkový obsah fenolických zlúčenín v jablkovej šťave upravenej lakázou sa pred skladovaním pri teplote 4 °C významne znížil. Okrem toho sa celkový obsah fenolických zlúčenín počas skladovania v oboch skúmaných vzorkách tiež znížil (tabuľka 1). Výskum Sandriho a kol.72ukázali, že jablková šťava ošetrená enzýmami si môže zachovať svoju antioxidačnú aktivitu a obsah fenolických zlúčenín. Výsledky štúdie Lettera a kol. však...73ukazujú, že úprava pomarančovej šťavy hubovou lakázou môže znížiť obsah fenolových zlúčenín v nej až o 45 %.
Ukázalo sa, že fenolové zlúčeniny majú vlastnosti, ako je zachytávanie voľných radikálov, redukcia a zhášanie singletového kyslíka, prenos atómov vodíka a darovanie elektrónov voľným radikálom, čo z nich robí silné antioxidanty.74Preto boli v tejto štúdii použité metódy založené na DPPH a FRAP na vyhodnotenie vplyvu lakázy na antioxidačnú aktivitu jablkovej šťavy skladovanej v chladničke počas 14 dní (Tabuľka 2). Obe metódy preukázali zvýšenie antioxidačnej aktivity počas skladovania, čo môže byť spôsobené zvýšením voľných fenolových zlúčenín alebo tvorbou produktov Maillardovej reakcie (MRP), pričom produkty Maillardovej reakcie sú pravdepodobne príčinou zvýšenia antioxidačnej aktivity.75Neenzymatické reakcie hnednutia (vrátane degradácie kyseliny askorbovej, Maillardových reakcií a kyselinou katalyzovanej degradácie cukrov) produkujú hnedé pigmenty (melanoidíny). Medziprodukty degradácie kyseliny askorbovej a produkty degradácie cukrov (ako sú karbonylové zlúčeniny) môžu reagovať s aminokyselinami prostredníctvom Maillardových reakcií.76Hoci hnednutie ovocia a zeleniny počas skladovania bolo rozsiahlo skúmané, naše chápanie týchto reakcií zostáva obmedzené.77V porovnaní s metódou FRAP vykazovala jablková šťava ošetrená lakázou výrazne nižšiu antioxidačnú aktivitu metódou DPPH (Tabuľka 2) a antioxidačná aktivita všetkých vzoriek sa výrazne zvýšila so zvyšujúcim sa časom skladovania. V tejto štúdii boli použité dve rôzne metódy na stanovenie antioxidačnej aktivity, pretože ich princípy sa líšia. Metóda DPPH meria schopnosť neutralizovať voľné radikály, zatiaľ čo metóda FRAP meria schopnosť redukovať ióny železa. Preto sa odporúča použiť viacero metód na stanovenie antioxidačnej aktivity, aby sa lepšie pochopila antioxidačná aktivita študovaných vzoriek.78
Jedným z kľúčových zistení tejto štúdie je, že lakáza NRC 620 z *Pleurotus ostreatus* vykazuje optimálnu aktivitu pri 70 °C a pH 3,0. V porovnaní s inými hubovými lakázami bežne používanými na čírenie štiav, ako sú lakázy z *Trametes versicolor* a *Ganoderma lucidum*, vykazuje *P. ostreatus* NRC 620 vyššiu tepelnú stabilitu a kyslejšie pH. Lakázy z *Trametes versicolor* a *Ganoderma lucidum* typicky vykazujú optimálnu aktivitu v rozmedzí 50 – 60 °C a pri hodnotách pH medzi 3,5 a 5,0. Tento rozdiel môže prispieť k zlepšeniu účinnosti čírenia štiav, najmä pri kyslých šťavách, kde je stabilita pri nižších hodnotách pH kritická. Jedinečnou vlastnosťou *P. V porovnaní s inými študovanými hubovými lakázami vykazuje *Pleurotus ostreatus* NRC 620 schopnosť efektívne fungovať aj v náročnejších podmienkach. Jeho vyššia optimálna teplota aktivity naznačuje potenciálne výhody v priemyselných aplikáciách, ako sú rýchlejšie reakčné rýchlosti a znížená mikrobiálna kontaminácia. Jeho nízke pH, ktoré je vhodné pre kyslú povahu mnohých štiav, môže byť užitočné v procesoch čírenia štiav. Tieto výsledky odôvodňujú ďalší výskum pre rozsiahle využitie, vďaka čomu je *Pleurotus ostreatus* NRC 620 životaschopnou alternatívou k tradičným hubovým zdrojom lakázy. V porovnaní s predchádzajúcimi štúdiami sme zistili, že optimálna teplota je 60 °C a optimálne pH je 3,0. Po reakcii pri 60 °C počas 80 minút si lakáza *Ganoderma lucidum* zachovala...46% jeho aktivity.79 Podľa Kurniawatiho a Nicelleho80Enzýmy *Ganoderma lucidum* vykazujú vynikajúcu až strednú stabilitu pri teplote 25 °C a hodnotách pH v rozmedzí od 5,0 do 8,0 a stabilitu pri pH 6,0 a teplotách v rozmedzí od 10 do 30 °C. V tejto štúdii sme zistili, že optimálne pH a teplota pre aktivitu enzýmu pre *Pleurotus ostreatus* boli 3,0 a 70 °C. Po inkubácii pri teplote 40 °C a 50 °C počas dvoch hodín si enzým zachoval 68,33 % a 59,61 % svojej aktivity. Okrem toho lakáza Pleurotus ostreatus NRC 620 vykazovala vysokú aktivitu v širokom teplotnom rozmedzí od 50 °C do 80 °C, pričom takmer dosiahla maximálnu aktivitu (69 % – 98 %), pričom maximálna aktivita bola pozorovaná pri 70 °C.
Záverom možno konštatovať, že lakáza NRC620 z hlivy ustricovej, získaná za statických podmienok, preukázala optimálnu aktivitu a stabilitu v celom rozsahu pH a teplotných podmienok, čo dokazuje vynikajúcu stabilitu v porovnaní s inými zdrojmi enzýmov. Pridanie 10 mM MgSO₄ a CuSO₄ zvýšilo aktivitu enzýmu približne o 21 %, respektíve o 35 %. Po spracovaní na jablkovú šťavu enzým znížil pH a viskozitu, zatiaľ čo obsah fenolov sa počas skladovania znížil len mierne.
Výsledky potvrdzujú potenciál lakázy v potravinárskom priemysle, najmä pri čírení nápojov. Cieleným rozkladom fenolických zlúčenín lakáza nielenže znižuje zákal a zlepšuje čírosť, ale tiež udržiava kvalitu ovocných štiav za miernych prevádzkových podmienok. Na rozdiel od tradičných číriacich činidiel, ako je želatína, bentonit a silikagél, lakáza neprodukuje odpad ani neodstraňuje príjemné arómy z nápojov, vďaka čomu je ekologickejšou a udržateľnejšou možnosťou. Okrem toho v porovnaní s inými enzýmami a metódami filtrácie ponúka lakáza cielené a nákladovo efektívne riešenie bez kompromisov v kvalite produktu.
Kyomuhimbo, HD a Brink, HG. Aplikácie a stratégie imobilizácie lakáz obsahujúcich meď; prehľad. Heliyon 9, e13156 (2023).
Čas uverejnenia: 15. decembra 2025